Miyo Spiral: Práctica 2 Tinción de Ziehl Neelsen

INTRODUCCIÓN

La tinción de Ziehl Neelsen fue desarrollada inicialmente por Paul Ehrlich para poner de manifiesto la presencia de los bacilos causantes de la tuberculosis en muestras clínicas de pacientes.

Esta técnica es capaz de diferenciar los bacilos Acido Alcohol Resistentes (BAAR).

Ácido-alcohol resistencia es la propiedad física de algunas bacterias a la resistencia a la decoloración de la fucsina básica (rojo) la cual penetra en la célula por acción del fenol y el calor.

Las bacterias ácido-alcohol resistentes no pueden ser clasificados según la tinciónde Gram, la cual es la técnica más común en la microbiología contemporánea, sin embargo puede ser teñido con algunas tinciones concentradas combinadas con calor. Una vez teñida tiene la capacidad de resistir la decoloración de una combinación de alcohol- ácido, el cual es el decolorante más común en los protocolos de tinción de bacterias, de donde viene el nombre Alcohol-ácido resistente.

La técnica de Ziehl Neelsen fuerza la penetración de la fucsina básica en la pared celular mediante la acción combinada del fenol y el calor, que aumentan la fluidez de la capa de ácidos micólicos: el calor “derrite” el componente ceroso y el fenol actúa a modo de disolvente, permitiendo el paso del colorante básico que se une a los ácidos micólicos con carga negativa. Cuando cesa la aplicación de calor y/o se elimina el exceso de fenol mediante un lavado con agua, la pared recupera su consistencia cerosa, pero las moléculas de fucsina quedan atrapadas en su espesor.

Con la coloración de Ziehl Neelsen se observan como bastoncitos delgados, ligeramente curvos, rojo fucsia, destacándose claramente contra el fondo azul.

MATERIAL

Portaobjetos
Soluciones de Carbofucsina o Fucsina-fenicada, Ácido-alcohol, Azul de Metileno.
Microscopio
Mechero de bunsen
Aceite de inmersión
Agua destilada
Hisopo

MÉTODO

Se prepara el frotis de forma habitual y se ﬁja por calor
Aplicar fucsina-fenicada. Deje que el colorante permanezca sobre los portaobjetos durante 5 minutos..
Calentar con un mechero hasta la emisión de vapores (3-5 minutos). Se requiere el tiempo adecuado para que la fucsina fenicada penetre y tiña la pared celular de la bacteria. No deje que hierva o se seque el colorante.
Lave suavemente el colorante de cada portaobjetos con agua corriente fría hasta que toda la tinción libre quede lavada. Retire el exceso de agua.
Decolorar con alcohol-ácido y manténgalo sobre el portaobjetos durante 7 minutos. Si no se decolora suficientemente, el contenido del esputo que no son bacilos TBC puede permanecer teñido.
Enjuague con agua una vez más los portaobjetos y quite el exceso de agua. Si los portaobjetos aún están rosa, aplique una cantidad adicional de la solución decolorante de 1 a 3 minutos.
Aplique la solución de contraste, azul de metileno, durante 1 minuto.
Vuelva a enjuagar con un leve chorro de agua e incline cada portaobjetos hasta drenar el exceso de agua. Finalmente, coloque cada portaobjetos en una gradilla a que sequen al aire.
Colóquele una gota de aceite de inmersión y haga la observación al microscopio con 100x.